苹果离体叶片植株再生研究进展

摘要　对影响苹果离体叶片植株再生的主要因子，包括基因型、叶片来源和接种方式、培养基及其添加物、黑暗培养等研究进展进行了综述，并提出了存在问题及今后发展方向。

关键词　苹果　离体叶片　组织培养　植株再生

苹果(MaluspumilaMill.)是世界四大水果之一，在我国栽培面积、产量和消费水平均位居水果之首。近年来，为了进一步提高苹果的抗病性、抗虫性、抗逆性等，采用基因工程技术将特定的目的基因导入苹果，在保持原有优良性状的基础上改良苹果的遗传特性，为苹果遗传育种提供了新技术，加快了苹果新品种的育种进程。但是基因工程技术的应用要求高效的不定芽再生体系，而苹果再生率低、生根难等问题成为对其进行遗传转化的主要障碍，探索出一条适合的再生系统将会大大促进苹果基因工程育种的发展。随着人们对苹果离体叶片再生植株影响因素及生理机制等研究的不断深入，目前，科研工作者们已经从乔纳金、富士、昌红、嘎拉、2001富士、宫藤富士、皇家嘎拉、千秋、寒富、新红星、鲁加16号等苹果栽培品种和M₂₆、P₅₉、平邑甜茶、M₇、罗6、珠美海棠等苹果砧木品种的叶片离体培养获得了再生植株。苹果离体叶片再生体系的建立已经取得快速发展，现将有关研究进展综述如下。

1　基因型

越来越多的研究表明，基因型是影响苹果离体叶片再生的关键因素。不同品种需要不同的再生条件，而且具有不同的再生效率，这主要表现在不同基因型外植体获得高效再生频率时所需要的激素水平、分化所用最短时间以及再生的不定芽数均不同；还表现在不同的基因型外植体在其最适培养条件下具有不同的再生效率。时保华等用10个苹果品种的试管苗叶片作离体培养试验，发现再生能力的大小受品种基因型影响，三倍体品种Jonasty再生能力最强，其次是乔纳金、自由和帝国。赵政阳等对7个苹果品种试管苗叶片再生植株能力的比较发现，再生植株能力由强到弱的顺序为北斗、嘎拉、岩富10号、乔纳金、长富2号、秋富1号、金矮生。孙清荣等研究表明，不同倍性的苹果离体叶片有不同的再生能力，多倍体比二倍体容易再生不定梢，平均不定梢再生率，二倍体为68.4％、三倍体达98.4％、四倍体为93.3％；相同倍性的三倍体品种之间，离体叶片再生能力差异不大，而二倍体品种中不定梢再生率差异非常大，嘎拉和千秋可获得100％的再生率，而新红星仅为5％。因此，在试验中应尽量选择植株再生频率较高的基因型材料。

2　叶片来源和接种方式

大量研究表明，不同来源的叶片、试管苗继代次数和苗龄、叶片着生部位、叶片不同部位以及叶片的处理与放置方式均会对苹果离体叶片植株再生产生影响。Christel等研究发现，不同来源的苹果叶片，其再生能力由强到弱的顺序为试管苗、温室苗、根蘖苗。这可能是叶片生理状态不同所致。师校欣等对不同继代培养次数的富士、金冠、乔纳金苹果离体新梢叶片不定芽再生能力的研究结果表明，3个品种无菌繁殖系建立后第5次继代培养的离体新梢叶片不定芽再生能力均较低，随继代次数增加，再生能力稳定在较高水平。张汝刚等对柱型苹果鲁加16号叶片再生研究表明，试管苗的苗龄对离体叶片再生率和出芽数影响显著，培养25～30天苗龄的试管苗叶片再生能力最强，叶片再生率和出芽数分别为90.0％和3.6个，而小于20天和大于35天苗龄的叶片再生率显著低于25～30天苗龄。一般情况下，幼嫩组织比老化组织具有较高的形态发生能力。赵政阳等研究表明，皇家嘎拉同一新梢不同部位叶片再生能力存在差异，以新梢顶端将展开的幼叶再生能力最强；同一叶片的不同部位再生能力也不同，中部比顶部和基部的叶段更易于再生植株。孙清荣等研究了对叶片进行切块、划伤、横切、纵切和不切等处理对叶片再生的影响，结果表明，不同切伤方法对叶片再生不定芽能力没有明显差异，切伤和不切伤对叶片再生不定芽能力有很大影响，切伤是刺激叶片再生的重要因素。叶片的放置方式对再生的影响，不同报道差异较大，师校欣、邢倩等人认为，叶片反面向上放置再生效率高，而吴雅琴、王艳等人认为，叶片正放比反放再生效果好。

3　培养基及其添加物

3.1基本培养基及激素组成

离体叶片生长、分化所需的各种营养成分均由培养基提供，所以培养基的成分及配比对苹果离体叶片再生有决定性影响。

在苹果离体叶片再生不定芽的研究中，常用的基本培养基有MS、N₆、B₅、LS等几种。N₆培养基低盐，低N、Ca、Mg，高K，并具有较低的NH₄／NO₃比例，被认为是适宜的诱导培养基。大量试验表明，MS的效果明显优于其他培养基，所以通常选用MS作为基本培养基。

在再生培养基中激素的种类、浓度及配比对苹果离体叶片再生植株能力影响很大，细胞分裂素和生长素对苹果离体叶片的再生是必需的。细胞分裂素常用6-BA、KT、TDZ，大多数试验表明6-BA效果较好。6-BA常用浓度为2～10mg／L，不同基因型品种所用最适浓度不同。众多研究表明，与6-BA相比，TDZ是一种更高活性的细胞分裂素，对叶片再生不定芽有极大的促进作用，其效率比6-BA高出许多。张志宏等研究表明，新乔纳金在只附加6-BA的培养基上，叶片很难再生芽，而在只附加TDZ的培养基上叶片再生频率为32.0％。TDZ虽然可使叶片再生效率显著提高，但TDZ再生的芽呈簇状，茎难以伸长，将再生芽转入含6－BA的培养基可恢复正常生长。生长素常用NAA、IAA、IBA和2，4-D。但不同品种有其最适的生长素，富士叶片使用NAA的效果最好；乔纳金使用IAA效果最好，其次为IBA，而NAA的效果最差。一般6-BA与NAA浓度比在20：1左右有利于苹果离体叶片再生。

3.2添加物质

培养基中糖的类型对苹果离体叶片再生也有影响，再生能力由强到弱的顺序为甘露醇、蔗糖、葡萄糖、果糖。对苹果的研究表明，叶片外植体不定芽再生对蔗糖浓度变化反应不敏感，以30～40g／L为好，单独使用白砂糖、葡萄糖、山梨醇效果都不好，再生频率均较低。在苹果离体叶片再生试验中，再生培养基常用5-7g／L琼脂来固化。琼脂的纯度、用量均会影响培养基的化学和生理特性，并影响外植体对矿质元素的吸收。Welander等对苹果矮化砧的研究中发现，吉兰胶(Gelrite)作为凝胶剂，再生效果优于琼脂，但试管苗易出现玻璃化现象。陈喜文等研究表明，AgNO₃可以显著降低嘎拉苹果离体叶片再生培养基容器中的乙烯浓度，降低乙烯对不定芽分化的抑制作用，从而促进不定芽的形成。Romani等研究证明，在苹果叶片培养中添加水杨酸(sA)，可以抑制乙烯的产生，并促进体细胞胚胎发生及植株再生。培养基中加入适量的LH(水解乳蛋白)可以提高富士叶片再生芽频率，但LH浓度过高对叶片再生芽有抑制作用，LH浓度对再生叶平均出芽数没有显著影响。再生培养基中添加新霉素，富士和乔纳金叶片上愈伤组织数量都减少，叶片再生芽频率和再生叶片平均再生芽数都降低。还有研究表明，在苹果再生培养基中添加CH(水解酪蛋白)，可以增加不定芽再生率。

4　黑暗培养

一般认为，生长素见光容易分解，外植体通过暗培养可以促进细胞的分裂与分化，从而刺激外植体的分化。苹果离体叶片再生培养过程中，前期暗处理可以显著提高叶片再生频率。吴雅琴等研究表明，昌红离体叶片接种后不经黑暗处理而直接在光下培养，叶片不能直接再生，黑暗处理15天时叶片再生频率达到最高。梁美霞等报道，福早红离体叶片暗培养的最佳时间为15天，不定芽再生率达到92.86％。刘莉莉等研究新红星叶片再生时发现，接种后不进行暗培养叶片不能再生，暗处理3周后，叶片的再生频率和每片叶再生芽数达到最高，随着暗处理时间的加长，再生频率和每片叶再生芽数下降，当暗处理时间达6周时，叶片再生频率和每片叶再生芽数均为0。师校欣等研究了适当黑暗培养对苹果叶片再生的影响，发现暗培养对苹果叶片再生不定芽并非必需，接种后完全光照培养叶片也能再生，但经过黑暗培养可显著提高叶片的再生效率，暗培养3周对苹果叶片再生不定芽最为有利。因不同基因型品种对暗培养反应不同，为获得较高的再生效率需进行黑暗培养试验，以确定最适宜的暗培养时间。

5　问题与展望

影响苹果离体叶片再生的各种因素是相互作用的，只有通过选择最佳生理时期，改良培养条件，诱导控制其分化和发育的分子开关的开放等，综合所有的因素进行优化才能获得高效离体培养再生体系。虽然近几十年来苹果离体再生的研究已取得较大进展，但只有少数品种再生频率在80％以上，转化效率非常低，限制了苹果转基因技术的发展和应用。提高离体叶片再生频率是提高苹果基因转化效率的关键，今后还需进一步加强苹果离体叶片植株再生影响因子和生理机制的研究，为那些较难再生的苹果品种找出一个容易再生的条件。

另外，对于苹果离体叶片再生途径研究范围较窄，从已有的文献看，诱导叶片直接再生不定芽研究占了相当大的比例，对叶片再生不定胚和原生质体再生的研究较少。叶片直接再生不定芽获得再生植株周期短，操作简单，体细胞无性系变异小，能较好地保持受体植物的遗传稳定性，但出现较多的嵌合体。胚状体是由具有卵细胞特性的胚性细胞发育而来，这些胚性细胞具有很强的接受外源DNA的能力，是理想的基因转化受体系统，且获得的转基因植株嵌合体少，并为苹果原生质体培养奠定了基础。但目前苹果离体叶片胚状体再生还存在发生率低、一致性差、成苗率低等问题，而且胚性愈伤组织的全能性随着继代次数的增加，胚性细胞的再生潜力迅速丧失，这些方面都需要今后重点研究。相信随着分子生物学和植物基因工程技术的发展，苹果离体叶片再生的诸多问题将会得到彻底解决。