羊卵母细胞的体外成熟培养技术研究进展

佟桂芝，宋斌，董正德

（黑龙江省畜牧研究所，黑龙江　齐齐哈尔　161005）

摘要：卵母细胞采集方法分为从屠体卵巢和活体采卵两大类。屠体卵巢采卵主要有抽吸法和切割法。优点是成本低廉，可以变废为宝。缺点是胚胎的谱系不清。活体采卵技术有两种分别是腹腔镜采卵和超声波引导阴道穿刺采卵。其优点是对母羊损伤小、母羊利用率高、胚胎的谱系清楚。以及影响卵母细胞质量和产量的因素：激素、血清、卵泡液、生长因子等一些因素的作用。现介绍目前羊卵母细胞采集和影响体外成熟因素方面的研究进展。

关键词：羊；卵母细胞；采卵；体外成熟

中图分类号：S826.3　文献标识码：A文章编号：2095-9737(2016)09-0007-02

羊卵母细胞体外成熟（IVM）是进行体外胚胎生产（IVP）、转基因动物生产以及辅助生殖（ART）技术开展的基础和关键。通过在成熟培养液中添加激素、生长因子等促进卵母细胞成熟已取得一定的进展[1]。目前影响羊卵母细胞体外成熟的因素有以下几个方面。

1卵母细胞的采集

1.1屠体卵巢采集卵母细胞

从屠体卵巢获得卵母细胞主要有抽吸法或切割法。抽吸法是用18号或20号注射器针头从卵巢卵泡抽吸获得卵母细胞。切割法为切割卵巢组织分离卵母细胞。这两种方法能够得到大量不同时期的卵母细胞。这种方法的最大优点是材料来源丰富，成本低廉，但确定母畜的系谱困难[2]。

1.2活体取卵

1.2.1腹腔镜采卵腹腔镜采卵技术

腹腔镜采卵腹腔镜采卵技术[3]相对简单且高效。这一技术快速、廉价并且能够多次重复采卵，没有并发症。在对动物进行常规麻醉后进行，采卵大约耗时20min。腹腔镜采卵技术可以用于经过激素处理的母羊。每只绵羊每周可采卵2次，卵母细胞的回收率为68%，平均每只母羊每个发情周期能够采集到4.6枚卵母细胞。经超数排卵的山羊利用这一方法得到的卵母细胞回收率为75%～85%，平均每只山羊能够得到13.5个卵母细胞。这一技术的主要缺点是用吸管从卵泡中吸出卵母细胞时会导致卵丘细胞丢失。

1.2.2超声波引导阴道穿刺采卵

超声波引导阴道穿刺采卵[4]是一种安全的卵母细胞采集方法。卵母细胞回收率类似于腹腔镜采卵，但是能够看到和抽取的卵泡数量比腹腔镜采卵少。最好在对动物进行eCG和FSH单独或结合处理之后进行采卵，这样能够增加可采卵泡数量。该技术在山羊已经有应用，但是想要成熟的掌握这一技术需要很多的实践练习。

2.影响卵母细胞成熟的因素

2..1激素对卵母细胞的成熟起重要作用

在成熟液中添加促性腺激素（FSH和LH）和17β-雌二醇能够提高卵母细胞的成熟率。促性腺激素是哺乳动物体外培养核成熟的主要调节器。成熟液中添加促性腺激素有助于羔羊的卵母细胞的成熟。雌二醇可能刺激DNA聚合酶β和提高假雄原核生长因子的合成,这两种物质都参与细胞质的成熟。FSH起到诱发卵丘细胞扩散，暂时性抑制生发泡破裂，延迟第一次成熟分裂的时间，促进细胞质成熟。LH能增强卵母细胞的存活力，引起卵丘细胞变化，便于精子受精。绵羊卵母细胞的研究中，人们添加不同浓度的FSH和LH，O´Brien等添加FSH和LH的量均为10μg／mL[5]。

2..2卵巢的运输时间和温度

牛、羊卵巢从屠宰场获得。运输温度及时间很重要。牛卵巢在37～39℃保存8h，卵母细胞成熟率下降，25℃保存8h，成熟率没有明显变化(Yang等，1990)[6]。Moodie等[7]研究证明，绵羊卵巢在22℃保存数小时，卵母细胞成熟率无明显影响；体温条件，卵母细胞成熟率明显下降。孙桂金等（2006）[8]实验，运输温度在28℃卵母细胞成熟率显著高于22℃和35℃　。37℃接近绵羊体温，卵巢生理活动旺盛，卵巢在离体环境中得不到充足的营养物质，使卵母细胞中部分物质发生降解。卵巢的贮存温度对卵母细胞体外成熟的影响机理还有待进一步研究。

2..3血清对卵母细胞体外成熟的影响

在成熟液中通常要加10%～20%热灭活的血清，因为血清能够为COCs提供营养并且能防止透明带硬化[9]。大多数羊卵母细胞的体外成熟都用FBS。尽管在成熟液中的可以不添加发情山羊血清（EGS），但是在不加促性腺激素时，添加10%FBS、10%EGS或者10%ESS的成熟液培养山羊卵母细胞能够获得很高的成熟率。成熟液中添加5%发情牛血清能提高绵羊卵母细胞成熟质量。（赵晓娥等，2005）[10]实验证明，绵羊卵母细胞体外成熟时，添加血清显著地提高成熟率。

2..4生长因子

表皮生长因子(EGF)，胰岛素样生长因子(IGF)等均影响卵母细胞体外成熟[11]。表皮生长因子（EGF）能影响多种哺乳动物卵母细胞成熟和囊胚发生，也可能影响到绵羊和山羊卵泡生长和卵母细胞成熟。在有表皮生长因子存在的情况下绵羊卵母细胞能够获得更多的卵丘细胞扩展和更高的受精率。EGF添加量在3ng/mL以下对山羊卵母细胞体外成熟没有显著影响。在成熟液中添加50ng/mL　EGF能提高山羊胚胎生产率。在成熟液中添加神经生长因子恢复减数分裂的卵母细胞大于70%。而胰岛素样生长因子-1（IGF-1）不会对卵母细胞成熟产生影响[11]。在卵母细胞成熟培养液M199中加入EGF，发现浓度(1、10、100　pg／L)可促进卵丘扩张，显著提高卵母细胞达到M　II期比例。艾继辉（2003）[12]等证明：EGF可促进裸卵的成熟率。　鲁进等（2005）[13]研究表明，颗粒细胞分泌的IGF-1单独或与促性腺激素协同作用能促进卵母细胞成熟。宋凯等（2014）[14]本试验仅在成熟培养阶段的不同培养液(血清培养体系，FBS和牛血清白蛋白培养体系，BSA)中添加不同浓度VEGF(5ng/mL和10ng/mL)，结果添加血管内皮生长因子(vascular　endothelial　growth　factor,VEGF)两试验组卵母细胞成熟率提高到84.61％和82.87％(P＜0.01)；BSA体系中，2试验组成熟率分别提高到82.40％和79.21％　(P＜0.01)，无论是FBS体系还是BSA体系，添加VEGF的各个试验组成熟卵经受精后的胚胎发育都有不同程度的提高，且具有差异显著性。VEGF可能与血清中的未知因子协同作用，有效地提高了羊卵母细胞体外成熟率。

2..5卵丘细胞的影响

黄承俊等（2014）[15]试验表明：添加离散卵丘细胞能够显著促进机械裸卵（DOs）的体外成熟（57.98±14.27　VS　35.53±14.00，P＜0.05），对卵丘-卵母细胞复合体（COCs）具有促进趋势但差异不显著（76.66±5.77　VS　66.76±9.46，P＞0.05）；卵母细胞胞外卵丘细胞对共培养的DOs的体外成熟促进作用效果不明显（35.83±18.32　VS　35.53±14.00，P＞0.05）。结果表明：添加的离散卵丘细胞主要以旁分泌途径促进卵母细胞的体外成熟；3层及其以上胞外卵丘细胞能够提高其包裹的卵母细胞平均体外成熟能力的85.34％，添加的离散卵丘细胞能够提高COC平均体外成熟能力的16.18％，能够提高DO平均体外成熟能力的60.61％。

2..6卵泡直径、卵泡直径和卵母细胞成熟率相关

卵泡直径、卵泡直径和卵母细胞成熟率相关,　Crozet等[15]的实验表明成年山羊的卵泡直径和卵母细胞成熟力及早期胚胎体外发育力有直接的关系，　卵母细胞来自直径大于5mm的卵泡的经体外成熟、体外受精、胚胎体外培养发育到囊胚的能力明显高于小卵泡。但性未成熟山羊卵巢中卵泡直径大多数为2.5~3mm，所以从性未成熟山羊中很难采集到直径大于5mm的卵泡。因此从性未成熟山羊获得的卵母细胞在发育能力上比成年山羊低。卵母细胞直径与其发育能力有直接关系，直径大于135μm的山羊卵母细胞发育能力最强，直径小于110μm的卵母细胞不能成熟发育。直径大的卵母细胞发育能力强可能和MPF活性有关，直径较大的山羊卵母细胞经过体外成熟培养后其MPF活性明显高于直径小的卵母细胞。史文升（2008）[16]试验表明：卵泡直径2mm≤D≤8mm的卵泡中的卵母细胞体外成熟率明显高于8mm＜D卵泡中的卵母细胞的体外成熟率(P＜0.05)。将随机分成三组的卵母细胞分别培养18h（Ⅰ组）、22h（Ⅱ组）和24h（Ⅲ组），Ⅰ组成熟率(68.2％)显著低于Ⅱ组(78％)和Ⅲ组(81.8％)(P＜0.05)。卵母细胞来自于卵泡期卵巢的体外成熟率(81.7％)明显高于黄体期卵巢中卵母细胞的体外成熟率(70.6％)(P＜0.05)。卵丘-卵母细胞复合体(COCs)的质量决定了体外成熟率，A、B、C三级卵母细胞成熟率分别是87.3％、76.2％、29.2％，AB之间差异显著(P＜0.05)，均与C差异极显著(P＜0.01)。

2..7褪黑素的影响

活性氧(ROS)是决定卵母细胞成熟、胚胎发育及其形态改变的重要因素。王超（2011）[17]发现牛卵母细胞体外成熟时填加10~50ng/mL褪黑素能促进卵母细胞从MⅠ到MⅡ期的发育，提高核的成熟率，对于胞质线粒体的均匀分布卵丘扩展起促进作用。进行体外成熟过程中卵母细胞，氧气浓度、褪黑素的功能；高氧浓度下，褪黑素能显著促进牛卵母细胞成熟，这意味着褪黑素作用的发挥依赖于培养条件。李晓霞等（2015）[18]，添加10　M　褪黑素既可显著提高牛卵母细胞的成熟率(62.5　VS　77.8　)(P<0．05）；受精后胚胎体外发育的卵裂率(53.2　VS　67.6　)(P<0.05)和囊胚率(20.3　VS　35.4)。裸卵暴露在ROS中会导致减数分裂静止及卵母细胞退化。不同阶段卵母细胞抵抗ROS的能力决定着发育能力。

最近几年的科研在羊卵母细胞采集技术以及体外成熟技术上取得很大进展，使体外胚胎的移植妊娠率和产羔率有了较大的提高。弄清卵母细胞成熟的分子水平控制机制将有助于发现影响胎儿及胎盘发育的因素和造成胎儿异常及妊娠异常的原因是体外胚胎，最终提高体外生产羊、转基因羊及克隆羊等的胚胎质量和效率。

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