生鲜乳中微生物检测的方法

郝东海 （黑龙江省贝因美乳业有限公司 黑龙江安达 151400）

1 原理

微生物是影响生鲜乳质量安全的重要因素，生鲜乳的微生物质量控制指标为菌落总数。菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后（如培养基成分、培养温度和时间、pH、需氧性质等），所得1毫升（或1克）检样中形成的菌落的总数。

2 试剂和材料

平板计数琼脂培养基。胰蛋白胨5克，酵母浸膏2.5克，葡萄糖1.0克，琼脂15.0克，蒸馏水1 000毫升。将上述成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH值至7.0±0.2，然后将其分装于试管或锥形瓶内，121℃高压灭菌15分钟。

无菌生理盐水。称取8.5克氯化钠溶于1 000毫升蒸馏水中，12℃高压灭菌15分钟。

3 仪器设备

恒温培养箱（36±1℃），高压蒸汽灭菌器，冰箱 （2~5℃），恒温水浴锅（46±1℃）。天平感量（0.1克），均质器，振荡器，无菌吸管1毫升、10毫升或微量移液器及吸头，无菌锥形瓶（容量250、500毫升）。无菌培养皿（直径90毫米），放大镜或菌落计数器。

4 操作步骤

样品的稀释。以无菌吸管吸取25毫升样品，置于盛有225毫升生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1毫升，沿管壁缓慢注于盛有9毫升生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振荡试管使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。按上述操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用一次1毫升无菌吸管或吸头。根据对样品污染状况的估计，选择2~3个适宜稀释度的样品匀液，在进行10倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取1毫升样品匀液加入两个无菌平皿内。同时分别取1毫升生理盐水加入两个无菌平皿作空白对照。及时将15~20毫升冷却至46℃的平板计数琼脂培养基（可放置于46±1℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。

培养。培养基凝固后，将平板翻转，置36±1℃培养48±2小时。如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖以薄层琼脂培养基（约4毫升），凝固后翻转平板，按上述条件进行培养。

菌落计数。可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（Colony-Forming Units,CFU）表示。选取菌落数在30~300 CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30 CFU的平板记录具体菌落数，大于300 CFU多可不计数。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数。若片状菌落小于1/2平板，而另外1/2平板菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。

5 结果与报告

菌落总数的计算。若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克（每毫克）中菌落总数结果。若所有稀释度的平板上菌落数均大于300 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板多不可计数，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。若所有稀释度的平板菌落数均小于30 CFU，则应按稀释度最低的平板菌落数乘以稀释倍数计算。若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。若所有稀释度的平板菌落数均不在30~300 CFU之间，其中一部分小于30 CFU或大于300 CFU时，则以最接近30 CFU或300 CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

菌落总数的报告。菌落数小于100 CFU时，按“四舍五入”的原则修约，采用两位有效数字报告。大于或等于100 CFU时，第三位数字采用“0”代替位数，也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”的原则修约后，采用两位有效数字。若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。若空白对照上有菌落生长，则此次检查结果无效。称重取样以CFU/克为单位，体积取样以CFU/克为单位报告。