PCR实验常见污染的原因及对策

牛可可 （河南省新乡市新乡县农牧局 453003）

聚合酶链式反应（PCR）是分子生物学技术的一种，由于其反应特异性强，操作简单、快速，对纯度要求低，且灵敏度高等优点，被广泛应用于兽医实验室的检测、监测等工作中。PCR实验室布局要求严格，需设置四个区域，一是试剂储存和准备区，二是样本制备区，三是扩增反应混合物配置和扩增区，四是扩增产物分析区。进入各个区域进行操作必须遵循单一方向原则，避免交叉污染。虽然PCR实验室布局设计要求严格，但是在基层实验室实际操作中还会遇到一些污染问题。在实验过程中，极其微量的污染都会造成实验结果的不准确以致实验失败。

1 原因

环境污染，门把手、实验台、操作架、离心机、电泳盒等设备仪器污染。

工作人员操作不严谨造成污染。没有做到单一方向原则，手套、加样滴头等污染。

样本交叉污染。样本收集时，采样工具和容器消毒处理不严，容器污染、溢漏或容器外沾有其他样本而造成相互交叉污染。

试剂污染。试剂没有按预先需要分装，试剂与样本并放，PCR试剂配制过程中，加样器、容器和实验溶液被PCR核酸模板污染。

扩增产物污染。因为PCR产物的拷贝量大，所以极微量的PCR产物污染就可能造成假阳性。另外在操作时比较剧烈的振动，反复吸吹样品都可形成气溶胶，气溶胶是空气与液体面摩擦时形成，气溶胶的存在极易造成污染。据报道，一个气溶胶颗粒可含480 000拷贝，因而由其造成的污染是一个特别注意的问题。

克隆质粒的污染。在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比较常见。因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力，其污染可能性也很大。

2 对策

针对可疑污染设备仪器及污染源采用无菌水浸泡过的灭菌棉签进行擦拭，清洁所有可能的污染源。实验台面、超净工作台等可用现配制的双氧水等消毒剂擦拭清洁，紫外光照射时距离应小于90厘米，过夜消毒。

工作人员在操作过程中一定要遵循单一方向原则，各个区域实验用品及加样器专用，实验前应将该区域用紫外线消毒，以破坏残留的脱氧核糖核酸或核糖核酸。在不同处理区域进行相应的工作，样本处理与制备，混合物的配制与扩增，扩增产物的分析，产物的处理。工作人员一旦进入加样程序时，必须严格更换滴头，避免交叉污染。加样时避免液体飞溅，若不小心溅到桌面上应立即用相应的处理液擦拭桌面，且操作时手套需及时更换。操作多份样品时，应先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样可减少操作，避免污染，提高准确度。

在采样前对采样设备及容器进行相应的消毒灭菌处理（www.nczfj.com），消灭污染源。在取样时，严格操作规范，避免重复使用取样仪器，放置样本时要到位，避免外沾，封闭样本时避免溢漏、损毁。

准备专供本次实验使用的PCR试剂，分装成小份，不要将样品试剂与样品并放在一起。实验操作时，选择质量好、密封性好的离心管封装相应试剂。使用前预先离心，使管盖、管壁的液体甩至管底。开盖时避免用力过大、过猛造成液体溅出。PCR扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的超净工作台配制和分装，PCR用水应为高压的双蒸水，引物和dNTP用高压的双蒸水在无PCR扩增产物区配制，引物和dNTP应分装保存。

设置无模板对照，在第一时间发现污染信号，使用加样器时吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，切忌多次抽取，切勿形成喷雾，以免产生气溶胶，另外尽量在加完所有其它反应成分后才吸加模板。选用含尿嘧啶脱氧核糖核酸糖基酶（UNG）的试剂，有助于防止PCR产物引起的污染。

在每次PCR实验中都要设立阴阳性对照，选择阳性对照时要选择扩增度弱、重复性好，经各种鉴定是该产物的样本。如果阳性对照扩增度过强会产生大量不必要的扩增序列，反而会造成潜在的污染。做阴性对照时应同时做样本对照和试剂对照。每次实验结束后要及时清理工作台面，对各种仪器设备进行相应的消毒灭源工作，为下一次实验做好准备。