良种肉羊体外胚胎高效生产技术的研究

摘要：本研究旨在比较小尾寒羊6周龄、13周龄羔羊、成母羊激素处理后卵巢卵泡发育及体外胚胎发育的影响。通过促卵泡激素（FSH）和孕马血清促性腺激素(PMSG)处理，比较卵巢上2～8　mm卵泡的数量及体外胚胎的发育情况。结果表明：6周龄羔羊卵巢发育的卵泡数和采集到的卵母细胞数（58.3±1.7、41.6±3.2）都高于13周龄羔羊及成母羊的卵泡数和卵母细胞数（16.7±2.6、10.5±2.1；19.6±4.5、11.8±1.6），且差异显著(P＜0.05)。6周龄、13周龄羔羊卵母细胞受精后的卵裂率(64.1％±1.5％、63.8％±3.4％)及囊胚率(31.2％±1.9％、30.4％±3.7％)略低于成母羊组(67.4％±3.7％、34.4％±1.2％)，但没有显著差异(P>0.05)。

通过外源激素诱导，从羔羊获得大量卵母细胞，受精后进行胚胎移植，能显著提高良种母羊的繁殖潜力、缩短世代间隔，加速遗传改良进程。本研究旨在比较小尾寒羊6周龄、13周龄羔羊、成母羊激素处理后卵巢卵泡发育及对体外胚胎发育的影响。通过促卵泡激素和孕马血清促性腺激素处理，比较卵巢上2～8　mm卵泡的数量及体外胚胎的发育情况。

1材料与方法

1.1母羊选择

分别于2016年4、5、6月份，选择体况良好、年龄分别为成母羊、6周龄、13周龄羔羊各9只，共有27只，品种为小尾寒羊。

1.2母羊激素处理方案

成母羊组及羔羊组（6周龄组、13周龄组），分别在第一、二、三天的早6：00、晚18：00时肌肉注射2.5mL、1.5mL、1.0mL　FSH(20IU／mL)，并在最后一次注射FSH同时每只羔羊加注0.4　mL　PMSG(500　IU／mL)。

1.3卵母细胞的采集

母羊在注射FSH　48h后空腹、术部剪毛，在母羊腹下切一个切口，引出卵巢，用吸有约2　mL抽卵液　TCM199(5％发情羊血清、100IU／mL肝素、100g／mL链霉素、100IU／mL青霉素)的10mL注射器(接12号针头）吸一个卵巢表面2～8mm的卵泡。在实体显微镜下检出A、B级卵丘-卵母细胞复合体（COCs），记录所采集的COCs数，分别比较成母羊、6周龄、13周龄羔羊卵巢上发育的卵泡数及采集的卵母细胞数。

1.4卵母细胞的体外成熟

将采集到的卵母细胞在38.5℃、5%　CO2、饱和湿度培养箱进行24　h的成熟培养。培养方式为微滴培养法，滴上覆盖石蜡油。在直径为35　mm　的细胞培养皿作6～8个滴（100μL/滴），在培养箱预平衡2　h。成熟培养液为TCM-199（10％胎牛血清、10　μg／mL促卵泡激素、1　μg／mL促黄体激素、1　μg／mL雌二醇）。

1.5卵母细胞的体外受精

卵母细胞体外成熟24h后，挑选颗粒细胞扩散效果较好的进行受精。受精液为合成输卵管液(synthetic　oviduct　fluid，SOF)并添加20％发情羊血清、10μg／mL肝素、3%牛脱脂血清白蛋白（BSA）。羊冷冻精液在37℃水浴中解冻15s，然后将解冻后的精液缓慢加入5mL精子洗涤液SOF（10%发情羊血清、10μg／mL肝素）混匀后进行离心(1500r／min，5min)，离心沉淀后的精子团再用5mL　HSOF离心洗涤(1000r／min，5min)1次。去上清液后，用受精液将精子密度稀释至5×106个／mL用于体外受精。体外成熟的卵母细胞在受精液中洗1～2次，每20个卵母细胞移入50μL受精液滴中。

1.6早期胚胎的体外培养

精子与卵子受精培养24　h后在SOF液中洗涤2次后，移入预先在培养箱内平衡2　h培养滴内。将20～25枚受精卵分别移入100μL的发育培养液SOF(2％的必需氨基酸、1％的非必需氨基酸、2　mmol／L的谷氨酰胺、3　mg／mL　BSA、10　ng/mL　上皮生长因子）中，在38.5℃　、5%　CO2、饱和湿度的培养箱中继续培养7～8天。48　h统计卵裂率，每隔48　h半量更换培养液。第8天，统计囊胚率。

统计分析采用SPSS统计软件@Independent-samples　t检验和One-way　ANOVA进行方差分析。

2.结果

2..1成母羊、6周龄、13周龄羔羊卵泡数和卵母细胞数比较

由表1可知，6周龄羔羊卵巢发育的卵泡数和采集到的卵母细胞数都远远高于13周龄羔羊及成母羊的卵泡数和卵母细胞数，且差异显著(P<0.05)。摘取卵巢组卵母细胞获得率（80%）显著高于活体采卵组（65%）。

2..2羔羊个体差异对激素诱导效果的影响

在本试验中，通过激素诱导羔羊卵泡发育，羔羊之间差异较大。在获卵总数方面，获卵数量小于25枚的有4只，大于45枚的有8只，5只获卵数量在25～45枚之间，1只羔羊没有反应(见表2)。

2..3成母羊、6周龄、13周龄羔羊卵母细胞发育能力及不同取卵方式对体外胚胎发育能力的比较

由表3可见，6周龄、13周龄羔羊卵母细胞受精后的卵裂率及囊胚率与成母羊组没有显著差异（P>0.05）。其中成母羊组卵裂率及囊胚率略好于羔羊组。不同的取卵方式对体外胚胎的发育能力影响差异不显著。

3讨论

3.1母羊年龄对卵泡数及卵母细胞数的影响

不同月龄的母羊经外源激素处理后卵巢上发育的卵泡数及卵母细胞数差异很大。6周龄羔羊卵巢上发育的卵泡数及卵母细胞数最多，显著地多于13周龄羔羊及成母羊（P<0.05）。于勇等[1]试验证明：1月龄、3月龄羔羊超排处理效果上的差异与血液中FSH水平有关，较高的FSH水平会促进卵巢上卵泡发育。本研究结果也证明了这一结论。

3.2个体差异对激素诱导效果的影响

在本试验中，通过激素诱导母羊卵泡发育，羔羊之间差异较大。在获卵总数方面，获卵数量小于25枚的有4只，大于45枚的有7只，3只获卵数量在25～45枚之间，1只羔羊没有反应。可见，激素诱导羔羊卵泡发育存在较大的个体差异。这个结果与成年母羊的激素诱导效果相似。

3.3母羊年龄及不同取卵方式对卵母细胞体外发育能力的影响

本试验表明，6周龄、13周龄的羔羊所获卵母细胞在体外成熟、体外受精后的桑葚胚和囊胚率接近于成母羊(P>0.05)。赵宏远[2]试验证明，30～50日龄组与51～70日龄组所获得卵母细胞体外发育能力差异不大。Morton[3]试验证明，6～7周龄羔羊比3～4周龄羊卵母细胞体外受精后囊胚率高(21.4％VS17.4％)。陈晓勇等[4]报道，羔羊卵母细胞与成年羊卵母细胞体外发育能力是否有差异尚存在争议。Jorio等[5]研究表明，随着年龄增长卵母细胞在体外的发育能力增强，成年羊的卵母细胞发育能力强于羔羊，本试验结果证明羔羊卵母细胞的发育能力略次于成年母羊的。造成此现象的原因除了年龄因素外，也与体外培养体系、个体体况差异等因素有关，但其内在的机理还不是很清楚，需要扩大群体数量进一步研究。

4结论

本试验通过对成母羊及6周龄、13周龄羔羊进行FSH+PMSG外源激素处理，发现6周龄羔羊在激素诱导后卵巢上卵泡数显著高于成母羊及13周龄羔羊，获得的卵母细胞数也远远高于成母羊及13周龄羔羊；获得的卵母细胞经过体外成熟、体外受精、早期胚胎体外培养试验后，6周龄羔羊卵母细胞体外成熟、受精后发育的囊胚率与成母羊及13周龄羔羊结果相近。羊是多胎动物，一个卵巢上可以同时排多个成熟卵子，为了提高卵母细胞获得率，摘除一个卵巢并不会影响母羊以后的繁殖性能。

参考文献:

[1]　于勇，钟旭，王芬露，等.不同月龄绵羔羊卵泡发育的比较研究[J].中国畜牧杂志，2012，48（9）.

[2]　赵宏远．影响山羊幼羔卵泡发育与体外受精效果主要因素研究[D]．保定：河北农业大学，2009．

[3]　Morton　K　M，Catt　S　L，Maxwell　W　M，et　al．Effects　of　lamb　age，horm　one　stimulation　and　response　to　hormone　stimulation　on　the　yield　and　in　vitro　developmental　competence　of　prepubertal　lamb　ooeytes[J]．Reprod　Fertil　Dev，2005，17：593-601．

[4]　陈晓勇，敦伟涛，田树军，等．幼羔超早期繁殖技术研究[J]．中国农学通报，2010，26(2)：21-25．

[5]　Jorio　A，Mariana　J　C，Lahlou-Kassic　A，et　al．Patten　of　FSH　secretion　from　birth　to　4　months　of　age　in　two　Moroccan　ewe　breeds　varying　in　prolificacy[J]　．Small　Rumin　Res　，1999，33(2)：135-140．