利用16SrRNA基因序列鉴定奶牛乳腺炎致病菌的技术方法

奶牛乳腺炎是困扰奶牛业发展的四大疾病之首，是最常见、治疗花费最高的疾病之一，主要是由病原微生物在奶牛乳腺内感染引起的炎症反应。据统计，我国每年因乳房炎造成的经济损失达135亿元。可以引起奶牛乳房炎的微生物种类有很多，如细菌、病毒、真菌、支原体等，目前从患有乳房炎的奶牛乳汁中分离到了160多种微生物，以细菌感染比较多见，引发该疾病的致病菌主要有葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌，这三种细菌引起的乳腺炎占总发病率的90%以上。本研究中，通过对乳腺炎患牛乳汁的病原菌培养、分离及药敏试验后，得到乳腺炎致病菌株，通过对其16S　rRNA基因的序列进行分析，为该株致病菌的研究提供参考。

1、材料与方法

乳腺炎致病菌分离将乳腺炎患牛乳汁稀释后，分别接种到血琼脂平板和伊红美蓝琼脂平板上，恒温培养，观察记录菌落形态、大小及溶血情况，接种到肉羊培养基中增菌培养。

分离菌株药敏试验将上述分离的致病菌分别接种到肉汤培养基培养，周围黏贴药敏片，培养24　h，观察抑菌直径。

细菌学鉴定及致病性确定采用生化与革兰氏染色镜检，确定耐药菌形态，并进行细菌学分类。抽取分离培养后的菌液500　μL，腹腔注射健康小鼠，24　h后观察小鼠发病情况，如小鼠死亡则认定该菌株具有致病性。

细菌16S　rRNA基因克隆与测序使用细菌基因组DNA提取试剂盒对菌液进行基因组DNA的提取，后利用细菌16S　rRNA基因通用引物（F：5　7-　AGAGTTTGATCMTG-GCTCAG　-　3´;　R:5’-　TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’）进行细菌16S　rRNA基因PCR扩增（扩增体积为50lJL;条件为：95℃预变性5　min，94℃变性30　s，56℃退火30　s，72℃延伸90　s，30个循环；最后72℃终延伸10　min，4℃结束反应），电泳以及胶回收后，连接pMD　-　18T载体连接克隆，经过筛选后将有16S　rRNA基因序列插入的质粒提取测序。

序列BLAST比对测序后的细菌16S　rRNA基因提交到NCBI，并利用BLAST软件进行序列比对，

2、实验结果

2..1致病菌株筛选以及鉴定结果

本次研究从27份乳腺炎患牛乳汁中分离出致病菌19株，其中经鉴定8株为葡萄球菌，6株为链球菌，5株为大肠杆菌。将上述分离菌株按照0.5　mL/只剂量腹腔注射健康小鼠，小鼠在24　h内全部死亡，因此分离菌株均有致病性。随机选取一株经细菌学鉴定为葡萄球菌的菌株，进行其16SrRNA基因扩增、克隆、测序后，进行序列分析。

2..2　　PCR扩增结果

利用细菌16S　rRNA基因通用引物扩增后，1%琼脂糖凝胶电泳结果见图1。

M:DL2000，泳道l和2为扩增产物，泳道3为阴性对照

扩增后电泳图片显示，在1422bp处有一特异性扩增条带，与目的片段相符。

2..3　细菌16S　rRNA基因序列及BI．AST比对结果

将扩增的PCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳分离后，采用DNA凝胶回收试剂盒进行回收纯化，将纯化的PCR产物与载体pMD-　18T连接后转化E．coli　b121进行克隆，经过筛选后将有16S　rRNA基因序列插入的质粒提取测序。序列提交到NCBI，并应用BLAST软件进行序列比对，结果显示：该序列与表皮葡萄球菌(　Staphylococcus　epidermi-dis)的16S　rRNA基因序列相似性为99%，因此本次分离的菌株为表皮葡萄球菌。

3、讨论

表皮葡萄球菌是滋生于生物体表皮上的一种细菌，故名。前人对乳腺炎致病菌研究中发现，致病菌为葡萄球菌属的有50.　7%为金黄色葡萄球菌，44.　8%为表皮葡萄球菌，因此表皮葡萄球菌是乳腺炎致病的重要病原菌之一[3]。

16S　rRNA基因具有高度保守的一级结构，种间差异小，1995年Amann建立了以16S　rRNA基因为PCR扩增靶分子的细菌快速分类鉴定的标准方法，该方法可以应用于细菌种、属和科的鉴定及系统进化分析等。目前基于高通量测序的细菌多样性检测，其理论基础就是基于细菌的该片段的此种特点发展而来的。

在临床条件下，快速、有效而准确的对病原作出鉴定对乳房炎的防治是非常重要的。运用PCR技术，对乳房炎病原菌的鉴定可以在数小时内完成，而且对种特异性16SrRNA基因扩增具有高敏感性和特异性，从而也提高了乳房炎病原的诊断水平，因此可以在乳房炎病原感染的早期或者在携带病原的奶牛乳汁中仅有很少量病原菌存在时就能被检测出来。