巴西龟白眼病病原的鉴别

杨瑞婷（甘肃省定西市安定区畜牧兽医局 743000）

白眼病，又称眼部发炎充血病，红眼病。发病季节多在春季、秋季和冬季，越冬后的春季为流行盛期。该病多见于巴西彩龟、乌龟、眼斑水龟、锦龟等，且以幼龟发病率较高，发病率一般为20%~30%，幼龟发病率可高达60%。病龟眼部发炎，充血，逐渐变成灰白色且逐渐肿大。眼角膜和鼻黏膜因眼部炎症而糜烂，严重时会双目失明，呼吸受阻。近年来，在华南不少省（区）巴西龟也成为主要的养殖品种，如湖南、海南、广西、福建等省不少农户都有规模化养殖巴西龟的实践。白眼病是巴西龟一种常见病，对巴西龟的养殖存在很大的影响。目前国内外对于巴西龟白眼病病原的研究很少，所以选择患白眼病的巴西龟为试验，通过对患白眼病巴西龟眼分泌物中病原的分离和培养，研究其生物学特性，从而确定其病原，对龟养殖业及宠物龟患白眼病的治疗具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验动物

本试验的样品均取自患白眼病巴西龟的双眼，共采集24个样本进行试验，试验动物的选择遵守以下标准：眼睑肿胀，眼部结膜囊下含有黄、白色奶酪样化脓块。在采集样品前，与巴西龟主人进行沟通，确认在到医院就诊并未应用过抗生素。

1.2 微生物培养的主要设备和鉴定试剂

DHP-9802 型电热恒温培养箱、SW-CJ-1B 标准型净化工作台、OLYMPUS CX31 型生物显微镜、DHG-9053A 型电热恒温鼓风干燥箱、手提式压力蒸汽灭菌器、HCTP12A2 电子称量天平、营养琼脂、麦康凯琼脂、三糖铁琼脂、M-H 琼脂、灭菌棉拭子、脱纤维绵羊血、血琼脂培养基基础、革兰氏染色液、一次性平皿（直径60毫米、90毫米）。

1.3 培养基的制备

将所需培养基粉末按照试剂说明与蒸馏水的比例加入烧杯中，经玻璃棒搅拌，加热使其全部溶解。高温灭菌后，待其冷却至50℃左右倒入无菌培养器皿中水平放置。待液体培养基凝固后即制成平板培养基。将菌种保存培养基分装入菌种保存试管中，每管装培养基约2.5毫升，制成45度斜面。将培养基置于冰箱冷藏室（4℃环境中）备用。

1.4 试验方法

样本采集。将乌龟置于掌心，用拇指和食指将巴西龟两前肢固定于龟壳内，使其头部露出壳外。用注射器抽取灭菌生理是盐水进行眼部冲洗，然后将生理盐水润湿的无菌棉拭子放置于下结膜囊内，由内眦向外眦反复旋转擦拭结膜囊数次，并在下结膜囊穹隆部留滞数秒，取出采样拭子，将其放入无菌转运管内；或者用润湿的棉拭子将结膜囊内的奶酪样化脓块取出，随棉拭子一起放入无菌转运管内。两眼均需采集样品，在操作过程中应避免接触睑缘皮肤。

样本接种。将双眼样本分别接种于血琼脂培养基和麦康凯培养基，置于37℃培养24~48小时。

培养结果判定。细菌一般培养24~48小时，某些细菌生长缓慢，（www.nczfj.com）可培养至72小时。若无生长，则为培养阴性。

巴西龟结膜囊内或奶酪样化脓块的细菌培养。样本接种于培养基24小时后开始观察，培养基生长出的细菌若为多种细菌共同生长的混合菌落，则需再进行单个菌落的纯培养。单菌落培养可用接种环垂直挑取所需细菌的单个菌落，点在另一个血液琼脂培养基或麦康凯培养基的第一区，用接种环划线、涂布。第一区接种后烧红接种环，再划第二区，依次接种至第四区。将接种单个菌落的培养基放于同样条件下培养24~48小时。以备生化鉴定之用。

记录纯培养细菌的相关数据。观察纯培养后细菌的菌落特征，测量菌落直径，可分为大（大于3毫米）、中（2~3毫米）、小（小于1毫米）三种。记录菌落性状、表面粗糙或光滑程度、高度、外形、边缘、硬度、色泽、溶血性等。

巴西龟结膜囊内细菌的生化鉴定。经过分离纯化后的细菌首先进行涂片和革兰氏染色，并在光学显微镜下进行观察。记录细菌的染色特征、形状、大小、排列等。初步将细菌分为革兰氏阳性球菌、革兰氏阴性球菌、革兰氏阳性杆菌、革兰氏阴性杆菌。通过氧化酶试验将革兰氏阴性杆菌分为肠杆菌（＋）和非发酵菌（－），触酶试验将革兰氏阳性球菌分为葡萄球菌（＋）、链球菌（－）和肠球菌（－），以及通过细菌生物学特性进行单个鉴别。

氧化酶试验是将氧化酶试验纸片贴于待检菌培养皿菌落上，数秒后观察，呈粉红色并迅速转为紫红色为阳性（＋）。

触酶试验。取3%过氧化氢溶液（约1毫升），加入不含血液的细菌培养物悬浊液中观察。培养物出现气泡者为阳性（＋），然后再结合各种生化鉴定试剂按照肠杆菌科细菌、非发酵细菌、葡萄球菌和链球菌分别进行下一步的鉴定。每项生化鉴定试验均做三个平行组，出现不同结果时，按照出现频率高的结果记录。

2 结果与分析

本试验共采集24例患白眼病巴西龟病例样本进行试验，共分离出了142株细菌，其中以革兰氏阴性杆菌97株，检出率68.31%；其次是革兰氏阴性球菌20株，14.08%；革兰氏阳性球菌14株，9.86%；革兰氏阳性杆菌11株，7.75%。革兰氏阴性杆菌中，变形杆菌22株，15.49%；柠檬酸杆菌16株11.27%；假单胞菌12株，8.45%；摩氏摩根菌10株，7.04%。革兰氏阴性球菌中，奈瑟氏菌8株，5.63%；革兰氏阳性球菌中，葡萄球菌10株，7.04%；革兰氏阳性杆菌中，棒状杆菌8株，5.63%。

3 小结

巴西龟白眼病眼结膜囊内革兰氏阴性杆菌检出情况与相关文献报道的巴西龟肠道菌群检出情况相似，所以巴西龟眼部革兰氏阴性杆菌的来源可能与其排入饲养水中的粪便污染水源有很大关系，从而导致眼部的革兰氏阴性细菌的感染。