罗非鱼链球菌病病原鉴定及中草药药敏试验

随着罗非鱼养殖业的迅猛发展，近年在广东、海南、福建、广西等省的养殖罗非鱼中暴发一种流行病—链球菌病，无论是网箱，还是池塘养殖的罗非鱼，都有此病的发生，主要危害亲鱼及100 克以上的幼鱼和成鱼。罗非鱼链球菌病是一种暴发性流行病，主要病理特征为眼球突出或混浊发白，眼眶充血，腹部膨大，肛门红肿，采食减少或绝食，游姿平衡失调，翻滚，转圈，解剖病鱼可见胆囊肿大，胆汁稀薄，色浅，肠腔充满淡黄色液体，肝脏增大。

近期，华南地区养殖罗非鱼出现链球菌病，其发病面积之广，危害程度之重很快成为业内关注的焦点，无论是罗非鱼饲料经销商、罗非鱼出口企业还是政府相关部门都表示了高度的重视。本文对广东省部分地区发病鱼体中进行罗非鱼链球菌病原进行分离鉴定及中药药敏试验，为该病的防治提供试验依据。

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一、材料与方法

1、病料

来自广东省广州、肇庆、番禺三个地区罗非鱼养殖场。

2、试验材料

营养琼脂培养基、血平板培养基（广东环凯微生物科技有限公司），细菌生化鉴定管（杭州天和微生物试剂有限公司），黄芪、板蓝根、茵陈、栀子、黄连、淫羊藿、五倍子、金银花、大黄、黄芩、黄柏、乌梅、野菊花、白头翁、秦皮、鱼腥草、紫花地丁各、蒲公英、天葵子、甘草及黄连等购买于广州市中药市场。

3、病原分离和形态观察

以无菌方法分别从发病鱼的肝、肾、脑等部位取一小块组织置于营养琼脂培养基平板划线接菌，于28℃培养24～48小时，挑取单个菌落进行纯培养。按常规方法对分纯菌株进行革兰氏染色、镜检以及溶血试验。

4、生理生化试验

取分纯细菌，分别接种于各生化培养管中，28℃培养48h，每天观察生化管颜色变化。

5、中药药敏试验

①中药的制备

分钟将中草药烘干后，按组方比例分别称取各药成分，每组药方共50克，按1:10比例加水煎煮3次，每次煮沸30分钟，集中3次煮出的药液进一步煎煮浓缩至100ml，即每毫升约含原生药0.5克，高压灭菌，于4℃冰箱中保存备用。各种药物浓度为中药干重占药液总体积的百分比（W/V）表示。

②药敏纸片的制备

选用新华1号定性滤纸，用打孔机打成直径为6mm的小圆纸片，根据需要将数片放入培养皿后包好，在121℃灭菌20分钟，置100℃干燥箱内烘干备用。将灭菌滤纸片用无菌镊子摊布于灭菌培养皿中，以每110张滤纸片吸收药液lml计，每张滤纸片饱含吸水量为0.009ml，不时翻动，使滤纸将药液均匀吸净，一般浸泡30min即可，同时设对照纸片，用灭菌生理盐水制备。然后取出含药纸片置于一纱布袋中，以真空抽气使之干燥。干燥后立即装入无菌小瓶中加塞，置于干燥器内或冰箱冰冻层中保存备用。

③药敏试纸平板的制备

采用药敏纸片琼脂平板扩散法。细菌纯化培养后，用灭菌生理盐水洗下菌苔，离心清洗3次，然后校正菌液浓度至108个/ml。将待检菌液各取0.2ml在普通琼脂平板上均匀涂抹，加盖后放置5min，用镊子将药敏纸片平放在平板上，并轻压使其紧贴在平板表面，两纸片中心相距不少于24mm，纸片与平皿边缘不少于15mm。于28℃培养24h，观察结果，每个处理设4个重复。

抑菌效果判定：抑菌圈直径≥20mm为极敏，用“＋＋＋”表示；15-19mm为高敏，用“＋＋”表示；10-14mm为中敏，用“＋”表示；10mm以下为低敏，用“－”表示。

二、试验结果

1、病原菌的分离提纯及镜检结果

经多次纯化分离后，得到3株细菌：普通营养琼脂平板上为隆起、不透明的小菌落；在血平板上，可观察到无色透明的溶血环，均呈β溶血；革兰氏染色阳性；菌体均为圆形、单个、两个或多个链球状排列。

2、生理生化鉴定结果

3株细菌的生理生化反应结果一致：发酵葡萄糖、半乳糖、蜜二糖、棉子糖、蔗糖、山梨糖、果糖、纤维二糖、蕈糖、麦芽糖、甘露糖；不发酵侧金盏花醇、阿拉伯糖、菊糖、卫茅醇、山梨醇、木糖、七叶苷；吡咯酮芳氨酶（PYR）呈阳性反应；V-P阴性、精氨酸酶阳性、赖氨酸酶阴性、不分解淀粉。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》(第9版) 中对链球菌的描述，初步鉴定此3株菌均为海豚链球菌(streptococcus iniae)。

3、药敏试验结果

  　24小时培养后取出检查，用标尺度量各个平板出现的抑菌圈，并记录结果。试验结果表明，对照纸片无抑菌圈出现；茵陈蒿散、三黄散、黄连解毒散、黄连解毒散改方、黄连素为中敏，表现出良好的抑菌效果。其余各组中药的抑菌圈直径均在10mm以下为低敏，抑菌效果不明显，具体结果见表1。

中药对罗非鱼链球菌抑菌效果观察（表1）

　　三、讨论

在水产养殖动物病害防治中，尤其选择用作全池泼洒的药物时，通常是要求所用药物能直接杀灭水体中的病原菌，或者能抑制病原体的繁殖和生长，达到控制病原菌的数量，从而实现防止疾病发生或扩展之目的。在选择用于口服的药物时，最好选择有促进水产养殖动物的生理代谢，增加正常的生理机能的药物，从而提高机体抗病力的作用。临床实践证明，如果对药物的选择得当，中草药就能同时满足以上方面的要求。因此在生产中因地制宜地选择具有抑制作用的中草药防治罗非鱼链球菌病，具有实际的应用意义。

本研究试验结果表明，某些中草药方剂如黄连解毒散改方、黄连解毒散、三黄散等都表现出良好的抑菌作用，也有部分中药方抑菌效果不明显。但在实际鱼病防治当中，某些中草药具有良好的防治效果但抑菌效果不好，分析原因，可能是中药并非是通过抑制细菌生长而起作用，而是通过加速机体新陈代谢，分解毒素，提高免疫功能而起治疗作用。