对虾中氯霉素残留的分析方法研究

一、引言

氯霉素（chIoramphenicoI，简称CAP）是1947 年首次从微生物中分离出来的一种抗生素[1]，目前用人工合成方法合成。氯霉素广泛用于动物各种传染性疾病的治疗[2]，被认为是抑制对虾病原弧菌作用最强的药物[3]。由于氯霉素存在严重的副作用，能引起人的再生障碍性贫血、粒状白细胞缺乏症等疾病，尤其是氯霉素在动物组织中的残留不仅对动物和人体有直接危害，更严重的是低浓度药物残留会诱发致病菌的耐药性，对人类的健康构成巨大的潜在危胁。许多发达国家相继禁止或严格限制使用氯霉素。欧盟提出了一些有关虾氯霉素污染的新规定[4]，进口虾中一旦被查出含有氯霉素，立即拒货，甚至销毁。我国也规定氯霉素在所有动物性产品中的检出量为零[5]。因此，建立高效、灵敏、经济的氯霉素残留分析方法是很有必要的。目前已相继建立起气相色谱[6]、液相色谱[7]、薄层色谱[5]、微生物[8]及酶联检测[9]等氯霉素残留分析方法，但这些方法在微量组分定量测定上均有一定的局限性。本工作建立了高效液相色谱-质谱-质谱联用技术（LC-MS-MS）测定对虾中氯霉素残留的方法。

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二、实验部分

1、仪器与条件

API3000液相色谱-质谱-质谱联用仪（美国生物应用系统公司）。液相色谱条件：C18 InertsiI 5 ODS-2 色谱柱（5μm，2.1mm X 50mm，MetaChem TechnoIegies Inc.）；甲醇（液相色谱纯，Tedia Company Inc.，USA）为流动相，流速为300μL/min，进样量为20μL。质谱条件：电喷雾电离源（ESI），负离子模式采集。

2、标准样品配制

准确称取一定量氯霉素（纯度99. 0%，Labor Dr. Ehrenstorfers，Germany），用甲醇溶解后配成一定浓度的标准储备液，使用时逐级稀释成浓度为0.56-56.00 μg/L的标准溶液。

3、样品处理

将去皮、头和鳍的对虾组织绞碎，准确称取2g，放入离心试管中，加入2mL乙酸乙酯，搅拌均匀，超声提取20分钟，4000r/min 离心10min，分离出上清液。重复提取一次，将2次的上清液合并，于45℃水浴上蒸发至大约0.5mL。用4mL乙酸乙酯分两次将提取物转移至另一支试管中，同时弃去不溶物。

再次将乙酸乙酯溶液蒸发至近干后，加入2mL甲醇溶解提取物，加入4%的NaCl溶液，摇匀；再加入正己烷，萃取，弃去正己烷层；向水层中加入乙酸乙酯，振荡，静置分层后，弃去水层；乙酸乙酯层经无水硫酸钠脱水后，浓缩至0.5mL，用于测定。向对虾组织中注射已知量的氯霉素，然后按上述方法提取，提取液用于回收率的测定。

三、结果与讨论

1、质谱条件的建立

用液相色谱法进行定量分析，有时一个色谱峰可能包含几种不同的组分，尤其是生物样品，成分复杂，如果仅靠峰面积定量，会给定量分析造成误差。为了消除干扰，实验采用串联质谱的多反应监测（MRM）技术[10]，这样得到的总离子色谱图进行了3次选择：液相色谱（LC）选择组分的保留时间，一级质谱（MS）选择分子量，二级质谱（MS/MS）选择子离子，因此可以认为这样得到的色谱峰没有任何干扰。然后根据峰面积进行定量分析。这是复杂体系中进行微量成分定量分析的有效方法。

氯霉素的结构如图1所示。其分子量为322（35Cl），一级质谱检测得到的准分子离子峰是m/z 321，为[M-H]-。对m/z 321做MS/MS，优化质谱参数后，得到氯霉素碎片离子，结果示于图2，主要质谱峰对应的可能子离子列于表1。因m/z 152是基峰（信号最强），故我们选取m/z 321/152为监测离子对，用于氯霉素的定量测定。

2、标准曲线的绘制

用甲醇作溶剂配制浓度分别为0.56、2.80、5.60、28.00和56.00μg/L的氯霉素溶液，然后用未注射氯霉素的对虾组织提取液将上述标准溶液分别稀释为浓度为0.28、1.40、2.80、14.00 和28.00μg/L的溶液。使用样品基质配置标准溶液，目的是消除基质中其他组分对测定结果的干扰。在确定的液相色谱质谱条件下，测定氯霉素的峰面积，以峰面积对浓度做图。结果表明：该方法线性范围为0.28-28μg/L。线性方程：Y=3160.40967X + 172.78247，相关系数r= 0.99991。

3、方法准确度和精密度

方法的准确度是用加入回收来衡量的。在对虾组织中准确注射一定量的氯霉素，按同样的操作过程进行提取、净化、测定，求出残留量，计算回收率。

实验选用了3个水平的加标回收控制以检验方法的准确度，结果列于表2。向2g对虾组织注射0.14ng氯霉素，其提取液经净化浓缩后为0.5mL，提取液中氯霉素为0.28μg/ L，刚好达到定量检测下限。此时对虾组织中氯霉素的含量为0.07μg/kg。逐步降低对虾中氯霉素的加入量，使被测物的信号等于噪音的2倍，以确定本方法的检出限，结果如图3 所示。通过实验确定，本方法的定量检测下限0.07μg/kg。

方法的精密度检验是采用同一个样品，重复10 次同样的操作和测定。所选用的样品是加标量为3.0μg/kg 的样品，结果列于表3。多次测定结果的相对标准偏差为2.1%，说明本方法有较好的精密度。

参考资料：

1、Bartz O R..Biol.Chem.，1948，（172）：445-450

2、Zhang Long（张龙）. Verterinary Medicine Chemistry（兽医药物化学）. Beijing（北京）：China Agricuiture Press（中国农业出版社），1999：280-282

3、Meng Oingxian（孟庆显）. Preuention Manual of Shrimps Disease（对虾疾病防治手册）. Oingdao（青岛）：Oingdao Ocean

University Press（青岛海洋大学出版社），1991：182-183

4、Chen Shuping（陈述平），Chen Ruiwen（陈瑞文）. Inland Fishery Production（内陆水产），2002，（5）：6-7

5、Hu Dingfe（i 胡顶飞），Shen Jianzhon（g 沈建中）. ournal of China Verterinarian（中国兽药杂志），2001，35（5）：55-57

6、Pfenning A P，Roybai J E. . AOAC Int. ，2000，83（1）：26-30

7、Typenou A E，Rigos G G，Athanassopouiou F.Lig.Chromatogr. Rel.Technol.，2002，25（4）：655-663

8、Jiang Dingguo（蒋定国），Yang Dajin（杨大进）.ournal of China Food and Sanitation（ 中国食品卫生杂志），2002，14（2）：44-47

9、Amoid，Somogyi.Assoc.of Anal.Chem.，1985，68（5）：984-989

10、Liu Mixin（刘密新），Luo Guoan（罗国安），Zhang Xinrong（张新荣），Tong Aijun（童爱军）. Instrument Analysis （分析仪器）. Beijing（北京）：Tsinghua University Press（清华大学出版社），2002：344-345