猪细小病毒致PK-15细胞病变的荧光显微镜和电镜观察

猪细小病毒引起的猪细小病毒病是猪的一种繁殖障碍性传染病，其临床症状主要为妊娠母猪流产，初产母猪产畸形胎、木乃伊胎、死胎等。PPV可在猪的多种传代细胞，如猪肾细胞、猪睾丸(ST)细胞、鸡胚成纤维细胞(CEF)、非洲绿猴肾细胞(　Vero)等中增殖，并引起明显的细胞病变r3_7　J。PPV和其他病毒一样在细胞内的生存周期包括吸附、穿人、脱壳、复制、包装和释放六个阶段，其入侵宿主细胞后会对细胞的生长活性和形态结构造成较大影响。目前关于PPV感染宿主细胞的超微结构的研究，还没有较为系统的资料。下面一起来了解一下：猪细小病毒致PK-15细胞病变的荧光显微镜和电镜观察。

为了解PPV感染过程中宿主细胞形态结构变化，本研究以PPV体外感染PK　-15细胞为模型，通过荧光显微镜、扫描和透射电镜观察细胞内超微结构病变特点，从细胞水平上了解PPV的致病过程，为致病机理的研究奠定理论基础。

1、材料与方法

1.1　材料

PPV和PK　-15细胞由本室提供。

1.2　细胞培养与病毒接种

PK　-15细胞应用10%胎牛血清(　FBS)的DMEM培养基培养。待细胞丰度为80%时接种PPV，37℃吸附th，弃去病毒液，用2%胎牛血清的细胞维持液继续培养。

1.3　DAPI染色

对数生长期PK　-15细胞接种于24孔细胞培养板，过夜培养后接种PPV(　MOI：1)，于感染24　h和48　h吸弃培养液，用4%多聚甲醛室温固定th，PBS洗涤3次，每次5　min。用DAPI染液（终浓度为0.1μg／ml）室温避光染色30　min，吸弃染液，PBS洗涤，荧光显微镜下观察，拍照。

1.4扫描电镜样品制备

将盖玻片置于6孔细胞培养板中，对数生长期PK　-　15细胞接种于培养板，约长成80%丰度接种PPV(　MOI：1)，于感染的24　h和48　h取出细胞爬片，PBS漂洗3次，2.5%戊二醛固定4h，PBS漂洗3次，10%的四氧化锇后固定2h，乙醇和丙酮梯度脱水，乙酸异戊酯置换，临界点干燥，表面喷金，S-　3000N型SEM扫描电镜(Hitachi)观察，拍照。

1.5　透射电镜样品制备

病毒感染的24　h和48　h收集细胞，用PBS清洗3次后转入1.5　mL离心管，2000　r/min离心3　min，吸弃上清液，缓缓加入2.　5%戊二醛1　mL，4℃冰箱静置2h，预冷的PBS漂洗3次，再以1%锇酸固定2h，梯度乙醇脱水，环氧树脂包埋，修块，切片，铀染，JEM-　2100型透射电镜(JOEL)观察，拍照。

2、结果

2..1　荧光显微镜下细胞形态的变化

对照组细胞核被DAPI染色，呈均匀蓝色荧光，细胞核膜完整，染色质均匀（图1　a），PPV接种PK-15细胞24　h即有细胞核出现皱缩现象，染色质边集（图lb），病毒感染48　h时，核染色质固缩的细胞数量显著增多，核明显发生聚缩和碎裂，可见到细胞膜失去完整性的晚期凋亡细胞（图1　c）。

3、讨论

PPV对体外培养的细胞具有一定的宿主选择性，虽可在猪原代细胞和多种传代细胞包括PK　-15、ST、A-72、IBRS-2、MDBK、Hela等上生长或繁殖，但引起的细胞病变特性却并不相同。据殷华平等、唐波等报道PPV在猪睾丸传代细胞ST及猪肾传代细胞PK-15、IBRS-2上传代后均能出现细胞病变，表现为细胞内出现弥散性颗粒，细胞变圆，有的细胞出现细胞间的融合、聚集，最后病变细胞开始崩解脱落，出现空斑。张磊等报道PPV在F81细胞较PK　-15细胞更容易培养，接种后18　h有部分细胞形态发生变化，感染24　h后大量细胞发生病变。但国内对于PPV感染细胞的超微结构的研究，还没有比较系统的资料报道，仅局限于普通显微镜下的病变特征。本研究选用PPV感染的敏感细胞系PK-15单层细胞制作扫描和投射电镜样品，可完整地观察到宿主细胞超微结构的变化过程。

本研究发现PPV在PK-15细胞内增殖能引起明显的细胞病变，如细胞变圆、核固缩等，继而出现细胞碎裂现象，这些普通光镜下的变化和其他学者研究结果相同；本研究应用DAPI染色，在荧光显微镜下观察细胞核的变化，发现随着PPV感染时间的延长，细胞核皱缩、变圆、染色质边集、碎裂，出现了细胞凋亡的典型特征，该结果与相海苓的研究结果一致。在病毒增殖过程中细胞超微结构也发生了相应的变化，主要表现为：PPV感染的24　h后，细胞微绒毛消失，表面粗糙不平，有较多的圆球状突起，粗面内质网严重扩张，而内质网的结构病变致使其功能受到严重破坏，进而引起细胞的正常代谢障碍，促进细胞凋亡的早期改变。此外PPV感染的细胞线粒体嵴肿胀、变暗，模糊不清，而线粒体是真核生物进行氧化代谢的部位，除负责细胞内氧化磷酸化，为细胞的活动提供了能量外，线粒体也与细胞凋亡过程紧密相关。PPV感染的细胞核染色质边集或分布异常，可见凋亡早期改变，说明线粒体的病变使细胞的能量代谢途径受到严重破坏，从而诱导细胞死亡或凋亡的发生。病毒感染的后期阶段，扫描电镜观察到细胞膜凹陷包裹细胞内容物成分的凋亡小体。投射电镜观察发现胞浆内有较多空泡，尤其细胞器空泡化严重，几乎无法辨认。本试验研究结果为了解PPV感染引起的细胞变化提供有力的超微病理学资料，有助于认识猪细小病毒与宿主细胞的相互作用，为猪细小病毒病的形态学诊断及致病机理的研究提供重要依据。