牛乳中嗜冷菌的危害 牛乳中嗜冷菌的检测方法

嗜冷菌在-15—20℃之间最宜生长，其在保存过程中产生的大量胞外耐高温的脂肪酶和蛋白酶会分解脂肪和蛋白质，所以在高温杀菌后仍有残留，从而造成牛奶腐败变质。为避免鲜牛乳发生变质,一般从收集到加工过程中都采取冷藏,但此时往往会导致乳中嗜冷菌占具主导地位,而其产生的耐热性酶类是主要造成鲜牛乳以及乳制品质量变差的一个主要原因.检测牛乳中细菌总数一般在37℃温度下进行48 h培养,但该条件下嗜冷菌不会生长,从而往往被忽视,应加强检测。下面就具体来了解一下：牛乳中嗜冷菌的危害 牛乳中嗜冷菌的检测方法。

1、来源

鲜牛乳中的嗜冷菌具有比较广泛的来源，且可分成较多类型的菌株，其中数量较多的是微球菌、假单胞菌以及产碱杆菌。微球菌分布比较广泛，主要存在于动物体表、空气、水源以及、设备上；假单胞菌属主要在海水、淡水、土壤以及多种植物体内存在；产碱杆菌主要在饲料、水源以及粪便中存在。在污染嗜冷菌的途径中，主要是通过接触个人，如药浴杯污染、挤奶工双手不卫生、水清洗乳头污染、贮存及运输设备不干净或没有严格消毒等，都容易导致嗜冷菌含量过高。

2、危害

鲜牛乳中主要为兼性嗜冷菌，产碱杆菌属、假单胞菌属、克雷伯氏杆菌属、黄杆菌属以及无色杆属等，是目前经常能够分离到的嗜冷菌。通过对以上菌株进行特性分析，发现其都会影响鲜牛乳的保存。例如，假单胞菌具有很强分解蛋白质和脂肪的能力，能够导致脂肪发生分解，从而容易形成脂肪哈败味，还能够使其中的蛋白质发生分解产生蛋白胨；产碱杆菌，自身无法使牛乳中的糖类发生分解而产酸，但能够生成棕黄色、灰黄色的色素，还能够导致牛乳中含有的有机盐发生分解而生成碳酸盐，从而导致牛乳呈碱性，能够造成乳制品发生黏性变质。也就是说，嗜冷菌能够使牛乳中的成分被破坏，这主要是由于嗜冷菌能够分泌耐热蛋白酶、脂肪酶而导致蛋白质、脂肪发生分解。另外，在有氧低温条件下，嗜冷菌能够引起生色反应，如黄色、奶油色、绿色、红色、金色、黑色或者棕褐色等。

另外，嗜冷菌分泌的胞外降解性酶类具有热稳定性，在巴氏杀菌过程中通常不会受到影响，即使经过超高温瞬时(UHT)处理依旧能够保持部分活性，从而析出UHT乳清和乳蛋白凝块。当牛乳经过UHT处理后储存较长时间，先会产生少量的小凝块，接着不断增大，并会沉在底部，而上部就会有少量的乳清液析出。同时，乳品会发苦，且在水解过程中产生的氨基酸会导致褐变反应更加严重。该菌产生的脂肪酶能够使牛乳中的脂肪球发生分解，生成游离的短链脂肪酸，从而导致牛乳酸度变大，造成腐败，且由于存在较多的游离脂肪酸会使脂肪上浮，使乳制品风味变差，形成腐烂味、乳酪味、肥皂味、酵母味或者不洁味等。此外，嗜冷菌分泌的蛋白酶、脂肪酶还能够导致片式热交换器形成淤塞，很难清洗。

3、检测方法

平板检测法。该法是取适量鲜牛乳样品，经过一定稀释后在琼脂培养基上接种，放于5～6.5℃恒温条件下进行10天培养，然后计数。或者取鲜牛乳样品置于21℃下进行增菌培养，再使用选择性培养基置于21℃下进行25h培养，最后检测其中G-杆菌用于判断嗜冷菌污染程度。

直接荧光过滤技术(DEFT)。该法是取适量鲜牛乳，先使用胰蛋白酶和TritonX-100进行处理，接着进行膜过滤，即可使乳中含有的微生物被留在过滤器上面。之后使用吖啶橙对滤膜上的细菌进行着染，再使用紫外显微镜观察。死亡细胞能够被染成绿色荧光，存活下来的细胞能够被染成橘黄色、橘灰色或者橘红色荧光，最后使用仪器对其进行计数。该法属于一种快速检测的方法，相比于传统的培养计数检测法具有较好的改善，且其与平板检测法的相关性系数能够达到0.91～0.94。该法优点是操作系统使用简单，通过图像分析仪在紫外显微镜下进行观察计数，每小时能够处理100个以上的样本，可用于较大的检测数量。另外，整个检测过程所需的时间要明显少于平板检测法，一般在th以内即可获得检测结果，已经在鲜牛乳中细菌的计数方面得到普遍的应用。该法的缺点是无法特异性识别嗜冷菌，只能够检测出冷藏鲜牛乳中细菌的总数，没有针对性。另外，如检测鲜牛乳样品中含有较少的细菌时，检测样品还需要提前进行预培养处理，促使目标微生物的数量增加，以确保检测结果的精确度提高。尽管检测时间非常短，但预培养需要较长的时间，通常需要24～48　h或者更久，因此在预培养阶段会相对增加耗时。此外，该检测方法要求使用的仪器价格较贵，且需要较高的检测成本，较难在实际工业生产中推广应用。

实时定量PCR(RQ-PCR)。该法是在普通PCR体系中添加适量的荧光染料或者荧光探针，从而对PCR反应过程进行实时监测以及同步分析荧光信号的累加，进而克服传统PCR只能够根据凝胶电泳进行定性判断的缺点。目前，该法趋于节约更多时间和检测成本，并在单一反应中实现复合PCR扩增的方向研究。该法的实现奠定同步检测鲜牛乳样品中多种优势嗜冷菌属的基础，相比于单一菌属的测定能够更准确的反映嗜冷菌总数。但是该法不能够区分样品中存在的DNA是来自死细胞还是活细胞。现在解决该缺陷的方法是在提取DNA和进行扩增前先添加一种染料，此时染料PMA或者EMA只能侵入死细胞，使DNA结构和细胞完整性被破坏，从而使死细胞中的DNA无法扩增。