4种溶剂法提取苹果类黄酮效果比较

摘要：以乙醇为溶剂，采用常温振荡法、液氮冷冻研磨法、匀浆法和超声法提取苹果果实中的类黄酮。结果表明，超声法最适于提取苹果果实中类黄酮，类黄酮提取率高，方法稳定。

关键词：苹果　类黄酮　提取方法　超声法　常温振荡法　液氮冷冻研磨法　匀浆法

类黄酮具有抗菌、抗病毒、消炎、抗过敏、扩张血管等生理功能，是维管植物中一大类多酚物质的总称，属植物次级代谢产物，现已鉴定出4000余种。苹果含有丰富的类黄酮，其提取方法主要有溶剂法、超临界流体萃取法和大孔吸附树脂法等，以溶剂法应用居多。提取苹果类黄酮常用的提取剂是甲醇、乙醇、丙酮的水溶液，乙醇较其他两种提取剂毒性小，溶解性能好，对植物细胞的穿透能力较强，不溶解蛋白质、果胶、淀粉和部分多糖等水溶性杂质，且提取液不易发霉变质。同一溶剂，采取不同的提取方法，其提取效果不同。我们以乙醇为溶剂，分别采用常温振荡法、液氮冷冻研磨法、匀浆法、超声法4种方法提取苹果类黄酮，以期探索提取苹果类黄酮最佳方法。同时，对分光光度法测苹果类黄酮含量的标准品、测定波长和显色稳定性进行了探讨。

1、材料与方法

1.1　材料及仪器

(1)材料辽伏苹果，于2009年7月下旬采自国家果树种质兴城苹果圃，冰箱中4℃下保存15天。

标准品儿茶素、芦丁，购自中国药品生物制品检定所，其他试剂均为分析纯。

(2)仪器设备TU-1800SPC紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)，SHB-III循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)，RE-52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)，BIOFUGE PRIMO型台式高速离心机(Thermo Electron Corpora-tion)，KQ-300DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，调速多用振荡器(深圳天南海北实业有限公司)。

1.2　类黄酮的提取

取10个大小均匀的辽伏苹果果实，清洗后擦干，将苹果去核，切成小片，混匀，平均分成4份，分别用如下方法提取类黄酮：

(1)常温振荡法取1份苹果样，用组织捣碎机匀浆1 min，称取10.00 g，加入80％乙醇30 mL，在往复式振荡器上室温(20℃)提取5 h，过滤，滤液在5300 r／min下离心10 min，上清液35℃减压旋转蒸发3 h，用甲醇移入棕色玻璃瓶中并定容至10 mL，冰箱中20℃下保存。

(2)液氮冷冻研磨法取1份苹果样，称取10.00 g，置研钵中，加入液氮，研磨，用80％乙醇30 mL移入烧杯中，混匀，放置10 min，真空抽滤。滤液减压蒸发、溶解、保存等按(1)操作。

(3)匀浆法取1份苹果样，称取10.00g，加入80％乙醇30 mL匀浆1 min，真空抽滤。滤液减压蒸发、溶解、保存等按(1)操作。

(4)超声法取1份苹果样，称取10.oog，加入80％乙醇，室温下避光超声提取3次。每次加10 mL 80％乙醇，提取时间分别为1 h、30 min和30 min，合并提取液，真空抽滤，滤液减压蒸发、溶解、保存等按(1)操作。

1.3　类黄酮含量的测定

参照文献[11]方法。用蒸馏水将样液或标准溶液定容至5 mL，然后依次加入5％亚硝酸钠溶液0.3 mL和10％氯化铝溶液0.3mL，摇匀，放置5 min，加入1 mol／L氢氧化钠溶液2 mL，用蒸馏水将溶液体积定容至10mL，旋涡混匀，测定510 nm的吸光度，根据标准曲线计算样液中类黄酮含量。

1.4　标准品和检测波长的选择

以试剂空白为参比溶液，分别吸取100μg／mL儿茶索溶液、100μg／rnL的芦丁溶液和样液各1 mL，按1.3操作，定容至10 mL后在波长190-900 nm的光谱下进行扫描。

1.5　显色稳定性实验

以试剂空白为参比溶液，取1 mL样液，按1.3操作，在2 h内，每间隔10 s测定510nm的吸光度。

2、结果与分析

2.1　标准品和检测波长的选择

由图1可知，在整个光谱扫描区间，芦丁和样液显色后吸光度变化趋势一致，而儿茶素和样液吸光度在190-300 nm的变化趋势差异比较明显。因此，芦丁作为样液类黄酮检测的标准品比较合理。芦丁和样液显色后在260、320、510 nm处均有吸收峰，但260 nm和320nm处于紫外区，且峰较尖锐，受干扰因素影响大，因此选择510 nm为样品的检测波长。

2.2　显色体系的时间扫描

由图2可以看出，在体系显色的最初22min内，样品或标准液在510 nm的吸光度迅速下降；22 min后趋于稳定，下降速率仅为每小时5％。因此，测定苹果类黄酮含量时，应在显色22 min后尽早测定，标准曲线绘制和样品的测定，从显色到测定之间的时间间隔均应一致。

2.3　4种方法的提取效果比较

4种方法提取的苹果类黄酮含量两两间差异均显著(表1)。超声法最好，类黄酮得率为0.042％，且稳定性良好，重复样之间的相对标准偏差为5.3％。匀浆法次之，类黄酮得率为O.035％，稳定性最好，重复样之间的相对标准偏差仅为2.5％。液氮冷冻研磨法再次之，类黄酮得率为0.023％，且重复样之间的相对标准偏差高达9.0％。常温振荡法最差，类黄酮得率为0.013％，重复样之间的相对标准偏差最高(达13.3％)。

3　讨论

对比试验显示，常温振荡法、液氮冷冻研磨法、匀浆法、超声法等4种方法中，超声法是苹果类黄酮提取的较适宜方法，类黄酮得率最高，而且操作简便，可进行样品的批量处理。超声波产生的强烈振动、高速和强烈的空化效应、搅拌作用等，有利于破坏植物细胞、加速有效成分浸出，从而提高提取效果，而且提取3次，能保证类黄酮提取完全。匀浆法提取，匀浆前加入提取剂80％乙醇，能有效防止试样中类黄酮的氧化分解，但类黄酮得率明显低于超声法，且显色后有少量沉淀生成，测定前需要离心。常温振荡法效果最差，可能的原因是，样品匀浆时未加入提取剂，再加之匀浆过程中样品升温，加速了样品中类黄酮的氧化分解。对于液氮冷冻研磨法，研磨过程中可见样品迅速氧化褐变，而且耗时长、样品研磨难以做到粗细均匀一致。